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Nature Communications volume 13, número do artigo: 2919 (2022) Citar este artigo

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Biossensores fluorescentes geneticamente codificados são ferramentas poderosas usadas para rastrear processos químicos em sistemas biológicos intactos. No entanto, o desenvolvimento e a otimização de biossensores continuam a ser um processo desafiador e trabalhoso, principalmente devido às limitações técnicas dos métodos de triagem de biossensores candidatos. Aqui descrevemos uma modalidade de triagem que combina microfluídica de gotículas e imagens automatizadas de fluorescência para fornecer um aumento de ordem de grandeza no rendimento de triagem. Além disso, ao contrário das técnicas atuais que estão limitadas ao rastreio de uma única característica do biossensor de cada vez (por exemplo, brilho), o nosso método permite a avaliação de múltiplas características (por exemplo, contraste, afinidade, especificidade) em paralelo. Como os recursos do biossensor podem variar, esse recurso é essencial para uma otimização rápida. Usamos este sistema para gerar um biossensor de alto desempenho para lactato que pode ser usado para quantificar as concentrações intracelulares de lactato. Este biossensor, denominado LiLac, constitui um avanço significativo na detecção de metabólitos e demonstra o poder da nossa abordagem de triagem.

Biossensores fluorescentes geneticamente codificados são ferramentas importantes para estudar o metabolismo. Seu sinal fluorescente fornece alta resolução temporal, tanto em escalas de tempo rápidas quanto durante imagens crônicas1,2,3,4,5, e por serem geneticamente codificados, podem ser expressos diretamente em células vivas e direcionados a tipos de células e organelas específicas6,7 . Como células individuais podem ser metabolicamente distintas e os metabólitos são revertidos em uma taxa rápida8,9, os biossensores permitiram medições precisas em células individuais de estados metabólicos basais e perturbações metabólicas em resposta a um desafio ou estímulo1,10.

Para quantificar as concentrações de metabólitos, a leitura de um biossensor fluorescente deve ser i) sintonizada para concentrações fisiológicas do ligante alvo, ii) altamente específica para esse ligante e iii) robusta contra mudanças no ambiente celular (incluindo pH) e no nível de expressão do próprio biossensor. A única maneira de desenvolver tais biossensores de alto desempenho é rastreá-los, testando muitas variantes individuais de grandes bibliotecas de biossensores à medida que são expostos a muitas concentrações e condições de ligantes.

Isso representa um desafio para a triagem de biossensores. Apesar dos avanços impressionantes na engenharia de novas plataformas para a evolução de proteínas fluorescentes e biossensores7,11,12,13,14, as telas existentes ainda são limitadas no número de condições que podem ser testadas contra o biossensor. Aqui superamos essas limitações, aumentando o conteúdo de triagem e o rendimento em ordens de magnitude, combinando microfluídica de gotículas e imagens automatizadas de fluorescência de dois fótons (2p-FLIM). O tempo de vida da fluorescência é o tempo médio entre a absorção de fótons e a emissão de fótons, e os sensores de vida útil surgiram como ferramentas de alto desempenho para quantificar os níveis de moléculas pequenas em células intactas . Aqui exploramos géis semipermeáveis produzidos microfluidicamente, chamados esferas de gel-shell (GSBs) que servem como câmaras de diálise em microescala e os usamos para testar milhares de variantes de sensores de vida isolados independentemente contra muitas condições diferentes, avaliando simultaneamente afinidade, especificidade e resposta tamanho.

Também mostramos como nosso sistema de triagem, BeadScan, pode ser usado para desenvolver e otimizar rapidamente biossensores fluorescentes geneticamente codificados. Como demonstração das capacidades da nossa tela, usamos o BeadScan para gerar um sensor de alto desempenho para lactato, denominado LiLac. O lactato é um produto chave da glicólise que foi recentemente apreciado como um importante combustível celular que circula no sangue, um meio de comunicar o estado redox através de células e tecidos, e um combustível preferido para certos tipos de cancro18,19,20. Os biossensores de lactato existentes têm sido usados para investigar o metabolismo no cérebro e em células cancerígenas21,22,23,24,25,26, mas cada um tem limitações que tornam a quantificação desafiadora (por exemplo, fraca sensibilidade a alterações fisiológicas no lactato ou respostas indesejáveis ao cálcio e/ou pH). LiLac exibe um grande tamanho de resposta (mudança de vida de 1,2 ns e uma mudança de intensidade> 40% em células de mamíferos), especificidade para [lactato] fisiológico e resistência ao cálcio ou mudanças no pH. Além disso, a resposta ao longo da vida do LiLac é muito precisa e não requer normalização, facilitando a quantificação das concentrações de lactato em células vivas. Assim, o LiLac constitui uma ferramenta poderosa para estudar o metabolismo no nível unicelular e demonstra as vantagens da nossa abordagem de triagem.

80% efficiency) as they pass a localized field generated by an electrode (10 kHz, 0.5 kV), at which point the amplified DNA is captured by the beads. c Addition of perfluorooctanol (PFO) breaks the emulsion, which separates into an aqueous phase containing the beads and an oil phase. The beads are then washed to eliminate residual unbound DNA. d The library of DNA beads is re-encapsulated in new droplets along with in vitro transcription/translation (IVTT) reagents using a custom microfluidic device that combines the two aqueous streams immediately prior to emulsification, mitigating premature transcription and mRNA cross-contamination. Only droplets containing a DNA bead will express fluorescent biosensor protein following an overnight incubation at 30 °C. e Finally, IVTT droplets are converted into durable semipermeable GSBs by controlled microfluidic merging with a mixture of agarose (gel in sol) and alginate (polyanion), followed by emulsion breakage by PFO in the presence of PAH (polycation). The two polyelectrolytes form a semipermeable shell at the surface of the gel scaffold, trapping proteins and DNA inside the gel but allowing small molecules (<2 kDa) to pass through17. Continuous exchange of ligands allows for the collection of full dose-response curves from the biosensor protein encapsulated in each gel during downstream screening. Scale bars represent 20 μm./p>200,000 clonal copies of >2 kb amplicons, and millions of beads can be prepared in parallel. However, optimal expression of soluble sensor protein was achieved with beads intentionally limited to ~100,000 copies of DNA by pre-blocking a subset of streptavidin binding sites, because more densely loaded beads sometimes led to the accumulation of visible protein aggregates within the droplet (Suppl. Fig. 1c). We also optimized the concentration of biotinylated 3’ primer included in the emPCR droplets. We found that using an excess of biotinylated 3’ primer led to poor results, presumably because the unextended original biotinylated 3’ primer competes with fully-extended biotinylated DNA for streptavidin binding sites. Therefore, we used a limiting concentration of the 3’ primer to ensure the complete extension of all biotinylated primer molecules, so that only fully extended amplicons are captured on the streptavidin beads./p>20 mL/min flow rates within a standard microscopy perfusion chamber, allowing rapid exchange of external conditions while fluorescence responses from the encapsulated biosensors are recorded using 2p-FLIM. After screening, single GSBs are retrieved with a microcapillary and DNA sequences are recovered by PCR amplification and Sanger sequencing (Suppl. Fig. 3)./p>5-fold reduced variability, and substantially higher signal to noise ratio (LiLacSNR ~ 25, Laconicdonor lifetime,SNR < 1; Suppl. Fig. 6a–c). Here, the SNR metric estimates the change in lifetime signal in cells from 0 to 10 mM external lactate relative to the average noise level at each condition. We also observed that the lifetime of the Laconic donor species varies widely across cells bathed in lactate (Suppl. Fig. 6b–c), as also observed with its FRET signal23. By comparison, the high precision of the LiLac readout suggests that the cell-to-cell variability observed with Laconic may be an artifact of the biosensor. While the source of this variability is undetermined, recent evidence suggests that Laconic may be partially degraded in cells, producing some fluorescence signal that is uncoupled from lactate binding23./p>40% (Suppl. Fig. 7), which is comparable to that of the most sensitive intensity-based lactate biosensor23, but with the added benefit of substantial pH resistance. Therefore, LiLac can also be used as an intensiometric biosensor, although additional normalization would be required for the quantitative determination of lactate levels./p>200,000 clonal copies of >2 kb dsDNA per 6 μm bead. Existing methods that immobilize primers on a bead and then amplify from the bead surface (e.g. BEAMing) are limited to ~1000 copies/bead for comparably sized amplicons and beads27,28. We presume that molecular crowding constraints at the bead surface limit amplification efficiency, while our method circumvents this problem by allowing the template DNA to be amplified in free solution in the droplet before immobilization on beads. This advance combined with optimization of the reaction conditions within the droplets allowed us to achieve micromolar expression levels of unique biosensor protein variants in IVTT droplets and subsequent GSBs./p>

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